无缝克隆连接一个质粒，加上载体一共三个片段，分别4kb多、5kb多和800多bp，试了三个牌子（Vanzyme的Clone Express、NEB的NEBuilder Hifi assembly、聚合美的M5 compact）都没连起来。然后想了想In-fusion的原理，觉得大概率是5’→3’外切暴露出DNA单链后产生了二级结构。毕竟反应温度是50℃，比正常PCR低多了。而20多bp的同源臂退火温度大概在60℃，可能形成二级结构影响同源臂之间的退火了吧。找了个网站预测了一下同源臂单链的△G：

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上面三条是之前的，下面三条是用引物重新PCR，把三个同源臂都向左边或者右边平移一小段距离，换一换序列。

然后一次就连起来了。

还有个用In-fusion克隆的小问题我今天才注意到。如果说原理是5’→3’外切酶切出单链，然后到感受态内部修复的话，那么如果连接时间过长，就会导致单链暴露区域过大，一方面形成二级结构的可能越高，另一方面修复出错的概率也越高，所以不应想当然觉得时间长一点连接效率更高，应该严格按照说明书推荐时间来连接。

参考：In-Fusion Cloning - Snapgene