图位克隆 | Eamon 's Blog

　　图位克隆，也叫位置克隆，基于与目的基因紧密连锁的分子标记在染色体上的位置来逐步确定和分离目标基因的技术方法。
　　图位克隆解决的是什么是问题呢？我们用一个例子来说明，野生型的水稻叶子都是绿色的，如果有一个黄色叶子的突变品系，在只知道黄叶这个性状的情况下，不知道任何蛋白水平和基因表达水平的信息，如果克隆到控制这一突变的基因呢？图位克隆可以解决这个问题。

　　我们高中就学过“基因连锁”这个概念，如果控制果蝇翅膀是长翅还是残翅的基因，与控制眼睛颜色是红色还是白色的基因在染色体上的距离非常近的话，那么往往由“长翅白眼”和“残翅红眼”为亲本，生下的子代也只有“长翅白眼”和“残翅红眼”，这称为基因的连锁现象。

　　但当产生的子代数量足够大的时候，我们可以观察到，仍然会有极少数的特例，出现“长翅红眼”和“残翅白眼”的子代。我们知道，这是由于同源染色体在联会时发生了交叉互换，产生了重组。

　　一个显而易见的事实是，“交换”发生的频率是与基因之间的距离远近相关的。比如右图中，A和B基因距离很短，发生重组的概率就很低；而A和C基因距离较远，发生的重组率就比较大。

　　反过来，我们通过杂交试验确定每两个基因发生重组的频率，就能根据重组率计算出基因在染色体上的相对位置和它们之间的遗传距离，绘制遗传图谱，或者叫基因连锁图。

　　这学期前几周我们在周老师的课上学过，基因组上存在种类多样的分子标记，这些分子标记遍布整个基因组，拥有相对固定的基因座位。
　　他们就像染色体上的一个个路标，比如右边的“简单序列重复”SSR，是少数几个碱基的串联重复，它的多态性在于不同个体中串联重复的次数不同。
　　图位克隆的核心原理就是找到与目标基因紧密连锁的分子标记，连锁越紧密，说明目标基因与该分子标记在染色体上的距离越近。就达到了对未知基因进行定位的目的。

　　下面通过实例来介绍图位克隆的实现步骤。

　　还拿水稻叶子颜色来举例，首先我们需要得到根据目的性状的差别分成的两个群体，这里使用的是“群组分离分析法”，即用纯合的野生型和突变株杂交，子一代自交产生子二代。可以看到子二代中绿色和黄色的比例是3:1，说明这是个隐形突变，下面就是看有哪些分子标记跟叶子颜色是紧密连锁的。

　　作者首先在水稻的12对同源染色体上找到了512个SSR标记，要计算重组率，首先要要求分子标记在两个性状间存在多态性，这样就剩下107个SSR标记，之后经过在F2中进行连锁分析，最终把基因定位在第5号染色体上RM516和RM5454这两个分子标记之间。

　　在初步定位的基础上进一步进行精细定位。这里的方法是利用更加细致的分子标记，可以将已有的遗传图谱整合，也可以利用软件自己设计新的分子标记，或者从其他科属生物中利用比较基因组的共线性获得分子标记。

　　这里作者是在初步定位的这段区域内，自己利用软件又设计了23对SSR引物。发现只有3个标记表现出多态性，然后绘制目标基因和这3个标记的连锁图，把定位进一步限制在零点几的厘摩范围内。

　　随后作者又在这零点几个厘摩范围内又设计了26对另一种分子标记，CAPS标记，它是基于单核苷酸多态性的，最终把范围限制在一个11kb的范围内。

　　我们可以具体看一下怎么进行连锁分析。
　　可以看到图示的3个标记在黄叶和绿叶两个亲本中条带大小不一样，说明串联重复次数不同，但是在后面所有的F2隐性单株当中，条带大小一致，说明这3个标记的遗传与黄绿叶基因的遗传紧密连锁。
　　这里只显示了一二十个F2单株，实际统计几百个几千个，里面可能出现若干大小不一的条带，根据这个计算重组率，就可以绘制遗传图了。

　　第三步，就是逐一去分析限定范围内的几个基因，哪一个是控制我们想要的那个性状的。
　　在这个例子里，11kb范围内只鉴定到两个ORF，作者最终发现黄叶突变是由YGL1这个基因发生了一个单碱基突变造成的。之后就可以克隆出来进行后续研究了。

　　在上个世纪，没有大规模测序，也没有像现在这么精细的分子标记的时候，用的更多的一种精细定位的方法是染色体步行。

　　基因组是被限制酶切割然后储存在文库里的一个一个克隆里面的。我们事先并不知道这些克隆的先后顺序以及目标基因在哪一个克隆里面。但我们通过分子标记已经对目标基因在染色体上有了一个大致定位。这时候从与它最近的分子标记开始（假设在目标基因上游，以这个分子标记的末端设计荧光探针，在文库平板上杂交。由于建库时限制酶消化是不完全的，克隆和克隆之间必然有重叠，所以这个探针杂交到的序列可能位于某个克隆的中间部位，再以新克隆的末端设计探针，以此类推，就像在染色体上行走一样逼近目标基因所在的克隆，直至找到它。