看了丁香园的一个直播视频,主讲是ThermoFisher公司的一个老师,做一点笔记。

一些需要格外注意的点:

  1. 阳性对照是上柱子前的Input,即全细胞或组织裂解液,目的是:

    1. 确认目的蛋白正常表达
    2. WB抗体可以成功检测到目的条带
    3. 确认目的条带位置
  2. 阴性对照是与IP抗体同种属的Normal IgG,目的是排除非特异性条带的干扰。

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  3. 抗体的选择不同于普通WB,普通WB是识别变性后的线性多肽的,而Co-IP要求检测细胞生理状态下蛋白和蛋白之间天然的相互作用,因此,能做WB的抗体不一定能做IP,在选择抗体时,注意看是否抗体公司的官网上是否标记了“经过IP验证”。最好还经过了“靶标特异性确认”(即Knockout确认)。

  4. 同上一条的原因,做Co-IP时裂解液的选择很重要,使用非变性温和裂解液,以免破坏蛋白-蛋白相互作用。

    1. 避免使用离子型去垢剂(如SDS),蛋白变性,破坏蛋白-蛋白相互作用
    2. 使用温和非离子型去垢剂(如NP-40, Triton X-100等)
    3. 生理离子浓度(如150 mM NaCl)
    4. 尽量避免剧烈超声和涡旋处理
  5. 对于磷酸化蛋白,除了添加蛋白酶抑制剂外还要添加磷酸酶抑制剂。

  6. 如果未富集到目的蛋白,可能是因为抗体在介质上固定不牢的原因。

    1. Protein A和Protein G对不同种类的抗体结合能力有差异,Protein A/G兼具Protein A, G的结合位点。
    2. MRZ师兄遇到过Binding Buffer中NaCl浓度过高导致IP蛋白结合不到抗体上的问题,降低NaCl浓度后就可以了。
  7. IP一抗的轻重链可能会被WB二抗检测到,如果跟待检测的目的大小正好撞车会很尴尬,设计实验时最好提前考虑到这个问题,选择与IP抗体种属无交叉反应的二抗。